犊牛腹泻是养牛过程中的一种常见病和多发病，主要由病毒、细菌和寄生虫等感染引起；其中由病毒引起的腹泻危害最大且最难防治。在我国引起病毒性腹泻的常见病原为牛肠道病毒（BEV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛轮状病毒（BRV）和牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等。病毒感染不仅会导致腹泻，还会使机体产生多种并发症，严重时可导致犊牛死亡，且感染后终身排毒，严重影响全球畜牧养殖业的健康发展，造成养牛业经济衰退。BEV、BCoV和BRV感染后的临床症状高度相似，仅通过临床诊断很难确诊，需要配合实验室检测确定病原。因此，急需建立一种精准、特异性强、灵敏度高的定量检测方法，来实现对以上病毒的检测和及时防控。
微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是数字PCR中应用最广泛的一种技术，是在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，其过程主要包括样本微滴生成、微滴PCR扩增和荧光信号读取。在样本微滴生成时，将待检样本PCR体系利用“油包水”技术分布到上万个独立的反应室中，使样本分离为单个的核酸分子，每个微滴都是一个PCR体系。微滴PCR扩增反应结束后，应用微滴分析仪收集荧光信号，利用泊松分布的公式得出核酸分子的拷贝数或浓度，从而达到绝对定量。微滴式数字PCR的优点在于高灵敏度、抗干扰能力强、无需标准曲线、缩短了样品处理时间以及比qPCR更低的检测限度，使其在动物疫病传播规律、快速精准检测及风险评估等系统性应用中具有广泛的应用前景。
澳门bet356体育在线官网史慧君教授团队在Frontiers in Veterinary Science（3.20，Q1）发表了一篇题为Establishment and Application of Multiplex Droplet Digital PCR Assay for bovine enterovirus, bovine coronavirus, and bovine rotavirus的研究论文，该研究建立了一种同时检测BEV、BCoV和BRV的ddPCR检测方法，检测灵敏度提高了370~1000倍。
在该研究中，研究人员基于病毒基因组的保守区域设计了特异性引物和探针，建立优化了检测BCoV和BRV的双重ddPCR，以及检测BEV、BCoV和BRV的多重ddPCR。结果表明，qPCR的检测下限为1000 copies/μL，而ddPCR对BEV、BCoV和BRV的检测下限分别为2.7 copies/μL、1 copies/μL和2.4 copies/μL。研究团队对某养殖场出现腹泻的82份犊牛粪便样本进行检测，双重ddPCR结果显示BCoV、BRV和BEV合并感染的检出率分别为18.29%、14.63%和6.1%。qPCR结果显示BCoV、BRV和BEV合并感染的检出率分别为10.98%、12.2%和3.66%。对另一养殖场68份样本进行检测，qPCR显示BCoV、BRV、BEV和BCoV与BEV共感染的检出率分别为14.49%、1.45%、5.80%和1.45%，多重ddPCR检测显示BCoV、BRV、BEV、BCoV和BEV共感染、BRV和BEV共感染的阳性率分别为14.49%、2.9%、8.7%、2.9%和1.45%。对另一养殖场的93份样本进行检测，qPCR显示BCoV、BRV、BEV以及BCoV和BEV的共感染检出率分别为5.38%、1.08%、18.28%和1.08%，多重ddPCR检测BCoV、BRV、BEV、BCoV和BEV共感染、BRV和BEV共感染的检出率分别为5.38%、2.15%、20.45%、1.08%和1.08%。以上结果表明，优化的双重和多重ddPCR方法比传统的qPCR方法更灵敏，特异性更强。
Sensitivity of the ddPCR assay
Results of clinical samples tested by duplex and multiplex ddPCR
综上所述，该研究在单重ddPCR系统的基础上优化出一种多重ddPCR检测方法，该检测方法的特异性强、敏感度高、并且能够同时检测BEV、BCoV和BRV，不但可以减少检测过程中的假阳性和假阴性，还有助于开发更好的诊断方法。
澳门bet356体育在线官网陈俊贞博士和李丹硕士为该文的共同第一作者，付强教授和史慧君教授为共同通讯作者。
该研究受到自治区杰出青年基金项目（2022D01E15）、自治区重大科技专项（2020A01001-2）和国家自然科学基金项目（32260881）等资助。